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知识分享:变性梯度凝胶电泳
点击次数:513 发布日期:2018-6-28  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

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实验原理

DNA 双链分子在全长不断增加温度或用化学变性剂条件处理下,两条链就会开始分开(即解链)。首先解链的区域由解链温度较低的碱基组成。GC碱基对比AT碱基对结合得要牢固,因此GC含量高的区域具有较高的解链温度。同时影响解链温度的因素还有相邻碱基间的吸引力。解链温度低的区域,通常位于端部称作低温解链区。如果端部分开,那么双螺旋就由未解链部分束在一起,这一区域便称作高温解链 (图1) 。

 

图1

如果温度或变性剂浓度继续升高,两条链就会完全分开。变性梯度凝胶电泳法依据首要的一点是:DNA双链末端一旦解链,其在凝胶中的电泳速度将会极剧下降。第二个根据是,如果某一区域首先解链,而与其仅有一个碱基之差的另一条链就会有不同的解链温度,其电泳速度也会有明显差别。因此,将样品加入含有变性剂梯度的凝胶进行电泳就可将二者分开(图 2, 1 和 2 道)。

 

图2

最终,如果一双链在其低温解链区碱基错配(异源双链),而与另一等同的双链相比差别仅在于此,那么,含有错配碱基的双链将在低得多的变性剂浓度下解链。事实上,样品通常含有突变、正常的同源双链以及配对的异源双链,后者是在PCR扩增加时产行的。而含有错配的双链(图2中的3和4道)通??梢栽对兜赜肓礁鐾此矗ㄍ?中1和2道)分开,这种分离效果使该方法灵敏度很高。为使仅有一个碱基之差的不同分子取得最好的分离效果,必须先选择所要研究的DNA范围以及电泳样品时变性剂浓度梯度。这可以按图 2 所示的正交变性梯度实验进行经验性地解决。变性剂梯度应选在曲线斜率大的部分,因为这时多数分子处于部分变性状态这使得落入低温解链区的不同分子达到最佳分离。

现在多数分析实验是加入了“GC夹板”(clamp)。它是将一段长度为30-50碱基,富含GC的DNA 附加到双链的一端以形成一个人为高温解链区。这样,片段的其他部分就处在低温解链区从而可以对其进分析。

实验材料

1、实验仪器:电泳控温槽一台、电泳支架、程控电泳仪、梯度混合仪一套、缓冲液虹吸泵、凝胶成像仪;

2、实验试剂:

(1)40%的凝胶单体(丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺:37.5/1):称取38.93g丙烯酰胺和1.07g甲叉双丙烯酰胺,加入去离子水定容至100ml后用0.45μm的滤膜过滤后装入棕色瓶4°C保存。

(2)100%变性剂:取42ml去离子甲酰胺、42g尿素,用去离子水定容至100 ml后用0.45μm的滤膜过滤后装入棕色瓶4°C保存。

(3)50×TAE缓冲液(Tris 2mol/L, 冰醋酸 1mol/L,EDTA 50mmol/L,pH8.0) ;

(4)10%过硫酸铵溶液(W/V,为保证良好的引发效果,建议现配现用) ;

(5)TEMED(分析纯)。

(6)梯度变性胶的配方(浓度为8%的变性胶)

 

组分

变性剂浓度60%

变性剂浓度50%

变性剂浓度25%

变性剂浓度0%

凝胶单体

2.8ml

2.8ml

2.8ml

0.8ml

100%变性剂

8.4ml

7ml

3.5ml

0

50X TAE

0.28ml

0.28ml

0.28

0.08ml

双蒸水

2.52ml

3.92ml

7.42ml

3.12ml

10%过硫酸铵

60ul

60ul

60ul

25ul

TEMED

8ul

60ul

60ul

5ul

总体积

14ml

14ml

14ml

14ml

(7)梯度变性胶的配方(浓度为6%的变性胶)

组分

变性剂浓度60%

变性剂浓度50%

变性剂浓度25%

变性剂浓度0%

凝胶单体

2.1ml

2.1ml

2.1ml

0.6ml

100%变性剂

8.4ml

7ml

3.5ml

0

50X TAE

0.28ml

0.28ml

0.28

0.08ml

双蒸水

3.22ml

4.62ml

8.12ml

3.32ml

10%过硫酸铵

60ul

60ul

60ul

25ul

TEMED

8ul

60ul

60ul

5ul

总体积

14ml

14ml

14ml

14ml

实验过程

1、将两块玻璃对齐放入电泳支架上(带缺口的玻璃缺口朝上并位于内侧),旋紧固定螺丝并夹好夹子。注入去离子水,检测是否漏水后倒出去离子水。

2、配制高变性剂浓度凝胶溶液和低变性剂浓度凝胶溶液,在灌胶前加入适量的10%过硫酸铵溶液和TEMED作为聚合引发剂和催化剂并充分混匀。关闭梯度混合仪的两个阀门,将高浓度变性剂凝胶溶液加入梯度混合仪靠近出口的一端,将低浓度变性剂凝胶溶液加入另一端,并打开磁力搅拌器。

3、先打开梯度混合仪出口端阀门,待液流稳定无气泡时将针头插入两块玻璃缝隙中部,接着打开梯度混合仪中间阀门开始灌胶。

4、待凝胶灌至距上端1.5cm处时停止灌胶,加入1mL去离子水液封胶面,待凝胶聚合后,配制不含变性剂的0%凝胶,用移液器灌胶,插好梳子,待凝胶完全聚合。

5、拔出梳子,将电泳支架放入恒温电泳槽,将各个PCR产物与Loading buffer混匀,然后用微量上样器吸取样品并加到各个上样孔中(每个孔的DNA含量为500-800ng,PCR产物在琼脂糖电泳时与Marker比较计算其大概含量,使得梯度变性胶每个孔样品中的DNA含量尽量一致)。 一切就绪后,准备开始电泳,电压设定为第一阶段60V,时间1h 第二阶段100V,时间16h,电泳仪全自动定时分段编程。

6、电泳结束后,拿出电泳架取出玻璃,将一侧玻璃揭去,用EB或SYBR Green染色30min后取出凝胶,置于凝胶成像仪中拍照。

注意事项

1、实验中提取DNA,以及DGGE操作中接触到得较多易挥发有机试剂和有毒试剂,操作过程中须注意做好防护。

2、胶浓度根据PCR产物片段长度选定,一般150-400bp的选用8%的胶,400bp以上的选用6%的胶。

3、变性剂浓度范围根据文献报道并针对具体样品做适当调整,使最终条带位于变性胶中部。

4、引发剂和催化剂的具体用量可以根据气温以及实验人对聚合速度的要求等具体实验情况进行调整,文档表格中列出的是参考用量。

5、配胶用的玻璃板须洗刷干净,避免杂质引起气泡等影响凝胶的一体性,加入凝胶液之前须注意检查玻璃板是否漏水。

6、拔取梳子的时候要注意切勿破坏上样孔,可先将凝胶放入电泳缓冲液中浸泡,然后拔取。

7、电泳槽中提前装入1×TAE缓冲液21L,温度设置为60°C,插上电极和缓冲液循环管,预热电泳缓冲液。

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来源:山东维真生物科技有限公司
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