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知识分享:Tet-on表达调控系统
点击次数:479 发布日期:2018-6-28  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

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1992年Goseen等人成功的利用原核基因调控元件构建了四环素(tetracycline,Tet)真核细胞基因调控表达系统。目前,此系统已被广泛应用于基因功能和基因治疗领域的研究。

 
1、四环素调控表达系统的基本原理

 

Tet调控表达系统通过诱导药物(如Tet)改变调控蛋白的构象,从而达到调控目标蛋白表达的目的。

最初的Tet调控基因表达系统是以大肠杆菌Tn10转座子上Tet抗性操纵子为基础而建立的。Tet阻遏蛋白(Tet repressor protein, TetR)与Tet操纵子(Tet operator, TetO)能够特异性结合。当细胞内无Tet存在时,Tet会与TetO结合,从而阻断下游抗性基因表达;当有Tet存在时,Tet使TetR构象发生改变,导致TetR与TetO分离,使下游抗性基因得以表达,细菌从而获得耐药性

2、Tet-on调控系统

利用TetR和TetO特异性结合的特点,多种类型的Tet调控系统逐渐发展起来。根据应用最为广泛的是Tet-on激活型系统。

Tet-on系统由调节表达载体和反应表达载体组成。

 

调节表达载体包含一个人巨细胞病毒早期启动子(PhCMV)和反义Tet转录活化因子(reverse tetracycline transcriptional activator,rtTA)。其中rtTA由反义TetR(reverse TetR, rTetR)和单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白C端的一段转录激活区域融合而成。

 

反应表达载体由Tet应答元件(Tet-responsive element, TRE)、最小CMV启动子(minimal CMV promoter, PminCMV)及目的基因组成。其中TRE是7个重复的TetO序列。

 

由于PminCMV缺少增强子,因此rtTA未与TRE结合时,目的基因不表达;当rtTA与TRE结合时,VP16会使PminCMV活化从而使基因表达。

在Dox不存在时,rTetR不能与TRE结合,导致基因表达被抑制;而当Dox存在时,rTetR能与TRE结合,进而使得目的基因表达。

 

 

3、Tet-on调控系统的优势

Tet-on调控系统集高效率、精准、安全、可逆性四大特点。

 

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来源:山东维真生物科技有限公司
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